1640培養(yǎng)基配法

關(guān)于RPMI 1640細胞培養(yǎng)液的配制1)配制培養(yǎng)基最好使用新制備的三蒸水。一般在試驗前當天或前一天制備為好。調(diào)節(jié)pH值的酸堿溶液也應(yīng)該使用這種水配制。2) 制備培養(yǎng)基的器皿清洗要絕對干凈，烤干后備用（濾器、濾膜、量筒、移液管及盛放培養(yǎng)基的小瓶等存放和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基液體的器具都應(yīng)進行滅菌）。3)溶解培養(yǎng)基：將干粉培養(yǎng)基溶于總量1/3的水中，再用水洗包裝袋內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中。振蕩或超聲助溶，一般不要加熱助溶。4) 補加試劑：根據(jù)包裝袋說明和試驗需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等其他試劑。5) 加抗生素：一般抗生素終濃度為――青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml。市售青霉素為80萬U／瓶，可溶于4ml體積，每一升培養(yǎng)液中加0.5ml即可。市售鏈霉素為100萬U／瓶，可溶于5ml體積，每一升培養(yǎng)液中也加0.5ml即可。無鏈霉素的情況下，用慶大霉素代替，終濃度調(diào)為50～200U/ml。6) 調(diào)pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情況下），然后用5％ NaHCO3調(diào)節(jié)pH到7.2~7左右) 過濾除菌：宜采用0.45um和0.22um濾膜各一張，上層為0.45um，下層為0.22um，以保證過濾效果。注意濾膜正面（光面）朝上。過濾后分裝于小瓶中（100或200ml）。8) 加小牛血清：根據(jù)培養(yǎng)基配制的量將小牛血清分裝，冷凍保存（－20℃）。臨用前將加入小牛血清(10%~20%)。

【注意事項】每次配液時，需要的其他輔助性液體（Hanks，胰蛋白酶消化液，PBS，抗生素溶液等）也可以同時配制，分別過濾。市售小牛血清使用前都應(yīng)該滅活（56℃，30min），以消除補體活性。動物血清個體差異大，故而每一批血清都進行嚴格檢測，同時進行無菌試驗。優(yōu)質(zhì)血清應(yīng)該為淡黃色，透明，無溶血，無沉淀，滅活后顏色稍深。生化檢測總蛋白含量3.5~4.5g/100ml，球蛋白不高于2g／100ml。選定一個效果較好的批號后，可一次多購該批號的血清，保證試驗條件的穩(wěn)定。由于市售小牛血清pH未知，但大多偏酸。試驗中加入小牛血清后，培養(yǎng)基的pH可能還會變化，故亦可先加入小牛血清后調(diào)pH值。但此種方法過濾較困難，只適于正壓過濾。培養(yǎng)液配好后，應(yīng)先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃溫箱內(nèi)置24～48hr，以檢測培養(yǎng)液是否有污染。每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止營養(yǎng)成分（主要為谷氨酰胺）損失，造成實驗繁瑣或者污染。